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轉錄組測序及分析

一、技術介紹

轉錄組一般指活細胞在特定狀態下所有RNA的總和,包括mRNA、tRNA、miRNA、rRNA等。
轉錄組測序主要針對mRNA進行高通量測序。無需物種基因組信息,快速獲得任意物種在特定組織和狀
態下全局的表達信息。

 

二、技術策略
1.文庫制備
mRNA回收:用poly T磁珠富集回收mRNA, 原核生物用試劑盒去除rRNA后,回收mRNA
文庫類型:常規文庫、DSN均一化文庫、鏈特異性文庫
2.測序方案
       測序平臺:Hiseq2000,Hiseq2500,
   測序類型:雙末端測序,PE100
   數據量:真核推薦不少于4G, 原核推薦不少于1G

三、技術路線

QQ截圖5.png
 

四、生物信息分析

 

1.有參考序列
1.1測序數據質控及評價
去測序接頭污染,并統計比例   去低質量序列并統計比例  去rRNA序列并統計比例
基因組覆蓋度及測序隨機性評估
1.2.基因表達分析
基因表達量計算(tpm、fpkm、rpkm)  差異表達基因分析(log2>1, fdr<0.001)
差異基因的表達模式聚類分析(樣品間聚類、基因間聚類)
差異表達基因GO功能富集分析   差異表達基因KEGG代謝通路富集分析
1.3.高級分析
基因結構優化  可變剪接及新轉錄本鑒定   SNP、InDel分析
差異表達基因蛋白互作網絡分析
2.無參考序列
2.1.測序數據質控及評價:
去測序接頭污染,并統計比例  去低質量序列并統計比例
2.2.Unigene分析
組裝結果分析(contig及unigene分析) Unigene功能注釋(COG、GO、KEGG數據庫分類分析)
預測CDS
2.3.Unigene基因表達分析
基因表達量計算(tpm、fpkm、rpkm)  差異表達基因分析(log2>1, fdr<0.001)
差異表達基因GO功能富集分析    差異表達基因KEGG代謝通路富集分析
2.4.高級分析
SNP 分析  SSR開發及引物設計  差異基因蛋白互作網絡分析
五、技術優勢
       1.直接測定轉錄本片段、單堿基分辨率;
       2.高靈敏度,檢測稀有轉錄本;
       3.無需基因組信息,直接對任何物種轉錄組測序分析;
六、案例分析
Transcriptome-based discovery of pathways and genes related to resistance against Fusarium head blight in
wheat landrace Wangshuibai. [BMC Genomics,2013]
文章中,研究者利用轉錄組de novo技術獲得小麥抗禾谷鐮刀菌品種Wangshuibai基因集、并結合數字
基因表達譜技術研究了Wangshuibai及其抗性突變株NAUH117。鑒定了與抗性相關的基因和代謝通路。
1、實驗設計
       通過轉錄組denovo測序獲得抗病品種望水白的基因集,并利用NR,GO,KEGG,Swiss-Prot等數據庫進
行功能注釋。在此基礎上,用數字基因表達譜技術在侵染24和48小時分別測定望水白及其敏感突變株
NAUH117基全局基因表達情況,鑒定抗性基因
2. 實驗結果
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七、常見問題

 


1.轉錄組測序對樣品有要求?
答: 1)組織樣品需大于2g, 植物材料應盡量選細嫩部位
        2)采樣后需用液氮速凍,保存于-80℃,使干冰運輸
        3)送樣管需標清樣品,用Parafilm膜密封,并與送樣單信息對應
        4)樣品保存期間切忌反復凍融
        5)RNA 樣品用Alilent2100 Bioanalyzer 檢測RIN值需在8.0以上
2. 轉錄組測序時,有參考序列和無參考序列對應的分析有哪些區別?
答:1)有參考序列時,會將測序數據與參考序列比對,統計Reads在基因組上的分布,評估測序隨機性
。無參考序列時會將測序Reads組裝得到Unigene。
2)有參考序列時,會進行新轉錄本預測,可變剪切鑒定。無參考序列時會對Unigene進行CDS預測
和功能注釋,并開發SSR標記。
3)無參考序列分析消耗較多資源成本較有參考序列相對較高