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miRNA測序及分析

  MicroRNA(miRNA)是一類內生的、長度約20-24個核苷酸的小RNA,是發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過 Dicer酶加工后生成。目前研究microRNA的方法主要是通過實時定量PCR以及基因芯片技術,這些方法主要關注microRNA的表達與定量,并 僅局限于研究那些序列信息或二級莖環結構信息已知的microRNA,無法尋找和發現新的microRNA分子。基于Illumina高通量測序平臺的 microRNA測序技術突破了目前研究技術手段上的局限性,使研究人員能夠直接對樣本中指定大小的所有microRNA分子進行高通量測序,在無需任何 序列信息的前提下研究microRNA的表達譜并在此基礎上發現和鑒定新的microRNA分子,并提供了更加靈活和深入的研究分析方法。

一、技術路線

二、數據分析

1.序列去雜(去除接頭序列、簡單序列等)

Rfam數據庫以及Genbank數據庫比對,去除rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的降解片段

mg电子平台鑒定mRNA的降解片段

同miRNA數據庫比對,鑒定miRNA

同參考基因組比對,預測新的miRNA

分析兩個樣品miRNA的表達差異

mg电子平台miRNA表達模式聚類分析

預測miRNA靶基因

三、實驗周期

  由于合作伙伴的個性化需求不同,實驗的周期也各不相同。從獲得合作伙伴樣品、高通量測序到數據分析,一般控制在30到40工作日內完成。

 

四、常見問題解答

1. 進行小RNA測序對于組織樣品提取總RNA有什么特殊要求?

答:如果要進行小RNA測序,提取總RNA時建議不要使用Qiagen等公司的過柱試劑盒,也不要使用LiCl沉淀,以免損失小片段RNA。除此之外也可以使用專用小RNA提取試劑盒來進行提取。

2.miRNA分析需要合作伙伴提供參考序列嗎?

答:需要,最好提供合作伙伴所做物種的全基因組序列,如果沒有,也可以提供近緣物種的全基因組序列或者是本物種的EST等序列作為參考序列,另外還需要老師提供相關的exon/ intron, repeat信息以及基因編碼序列。

3.為什么不同的樣品測序得到的reads數量相差較大?為什么說不影響分析準確性?

mg电子平台答:不同類型的細胞在不同時期表達的基因數差異很大,而通常用作total RNA提取的材料的細胞數差異也很大(通常為10~100萬個細胞),所以取材的時空及細胞總數的多少決定了樣品中表達的mRNA的總量不可能完全一致。 Reads數與樣品上機濃度、樣品GC含量和樣品自身特性相關,不同樣品間存在的差異是正常的。Reads數只會影響到數據量,數據量足夠分析就可以,不 影響準確性。同時,我們分析時采用RPKM標準化后的數據,這樣即使reads 數量相差較大,也不影響分析的準確性。

五、相關案例

1. 芯片與新一代測序對小RNA的分析方法比較

mg电子平台  來自丹麥的THOMAS LITMAN教授等人通過測序數據比較芯片與新一代測序方法。

  圖1 比較的數據;(A,B)為樣品信號與RNA濃度百分之九十五的置信區間的相關性;(C)為Illumina公司sequencing和microarray比率;(D)柱狀圖為合成RNA在每個濃度的錯誤發現率,柱條越低,敏感性越好。

mg电子平台2. 小RNA測序在人體胚胎干細胞的應用

mg电子平台2.1 兩個樣本的microRNA差異表達分析。

  利用數學統計的方法對不同樣品間的microRNA進行差異顯著性分析

  圖2 左邊箱線圖(圖A)表示8大類的小RNA在人類胚胎干細胞小RNA文庫的相關表達。其中miRNA是表達最高的一類。右圖為兩個文庫所有已確定的 miRNA不同表達值的對數平方根最高值(黑色為正常值),白色柱為在至少一個文庫中檢測到沒有不同表達的miRNA的對照組。

2.2 與數據庫進行比對注釋miRNA

mg电子平台  圖3 microRNA及其它不同種類的RNA分子所占比例統計。將得到的序列分別與miRBase數據庫、mRNA/EST數據庫、rRNAetc等數據庫進行序列比對,鑒定出已知的microRNA。

mg电子平台2.3 預測新的microRNA

  MicroRNA前體的標志性發夾結構能夠用來預測新的microRNA。將測序得到的序列比對到該物種的基因組后,截取附近區域的一段序列,通過折疊模型分析,如發現該序列位于莖環結構上,則初步判定該序列為一個候選的新microRNA(圖4)。

  圖4 新microRNA的預測

2.4 MicroRNA的表達模式聚類分析

  表達模式相似的microRNA通常提示功能的相關性。表達模式聚類分析把表達模式相似的microRNA聚到一起,便于篩選出感興趣的類別。

mg电子平台  圖5 人體胚胎干細胞的miRNA。紅色表示上調,淡黃色色表示下調,白色色表示在樣品中未表達的microRNA。

 

六、相關文獻

1. Ryan D. Morin, Michael D. O'Connor, et almg电子平台. Application of massively parallel sequencing to microRNA profiling and discovery in human embryonic stem cells. Genome Res. 2008 18: 610-621.

2. Hanni W, Jesper S, Rolf S, et al. Quantitative miRNA expression analysis: Comparingmicroarrays with next-generation sequencing. RNA (2009), 15:2028–2034.