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細菌/真菌16S rDNA/ ITS
一、技術簡介
16S rRNA基因是細菌上編碼rRNA相對應的DNA序列,存在于所有細菌的基因組中。具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長(包含約50個功能域)。16s rRNA基因檢測技術已成為病原菌檢測和鑒定的一種強有力工具。數據庫的不斷完善,應用該技術可以實現對病原菌進行快速、微量、準確簡便地分類鑒定和檢測。
在真核生物rDNA 基因中,18S rDNA 和 28S rDNA 基因間隔序列稱為(ITS),位于18S和5.8S的為ITS1區,位于5.8S和28S之間的為ITS2區。核糖體DNA中的18S、5. 8S和28S的基因組序列在大多數生物中趨于保守,在生物種間變化小,而內轉錄間隔區ITS1 和ITS2作為非編碼區,承受的選擇壓力較小,相對變化較大,可用于對細菌的不同生物型、菌株、種、屬進行分類鑒定。甚至用于區分關系非常近的種。
二、技術策略
設計引物擴增16S rDNA/ITS部分可變序列,采用Miseq平臺,得到PE 2 ×250部分重疊序列,拼接得到較長序列,通過與特定數據庫比對,從而確認某物種的存在與否,繼而進行生物信息分析。
三、技術路線
QQ截圖4.png

 
四、分析結果
1.    測序序列統計(質控結果統計)
2.     物種信息分類統計, alpha/beta diversity analyses
3.     OTU (Operational Taxonomic Units)分析及其進化樹
4.     序列注釋
5.     Unifrac clustering analysis;

五、案例解析


案例一
Scher J.U, et al. Expansion of intestinal Prevotella copr icorrelates with enhanced  susceptibility to arthritis. eLife,2:01202. (2012)
文章中用16S技術,對114份關節炎病人和健康人的糞便進行分析,并用進一步對另外44份樣品進行分析,找到了普氏菌與關節炎前期之間的關系。
1.      實驗設計
提取114份健康人和關節炎病人的糞便,采用16S技術,分析樣品中的細菌豐度,從而找出與關節炎相關細菌的菌種——普氏菌。采用meta分析方法,進一步驗證普氏菌的病原性作用。
2.      實驗結果
QQ截圖5.png
 
圖1. 健康人(HLT)和第一次得風濕性關節炎病人(NORA) 16S分析得到的不同的OTU及其大小
QQ截圖6.png
 
圖2. 通過樣品中菌種的豐度,能夠計算樣品間Bray-Curtis距離,從而可用PCA進行分離。(紅色對應的是普氏菌豐度較高的樣品,藍色對應的是多形桿狀菌豐度較高的樣品)
QQ截圖7.png
 
圖3. 不同人群中,樣品中普氏菌(紅色)和多形桿狀菌(藍色)之間的對立關系

案例二
   Caporaso J.G, et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth ofmillions of sequences per sample. PNAS, vol. 108: 4516-4522. (2011)
文章對IlluminaGAIIx測序平臺用于16S分析的可行性進行分析。結果顯示采用Illumina GAIIx 測序平臺測序進行的16S分析,在樣品菌群結構和復雜性分析等方面能夠達到宏基因組分析一樣的效果。
1.      實驗設計
提取25個環境樣品和3個已知的“mock communities”, 16S分析樣品中菌群結構和物種復雜程度,得到的結果與已發表的一些meta分析文章結果進行對比,對比這兩種方法在分析樣品菌群結構和復雜程度的差異與否。
2.      實驗結果
QQ截圖8.png
 
圖1. 采用Illumina測序平臺,同樣能夠重復出樣品中微生物在目和屬水平的分布,即豐度組成
QQ截圖9.png

               圖2. 通過聚類,能將同一來源的樣品很好的歸為一類

六、技術優勢

1.      強大的實驗測序平臺,測序周期短且可靠;
2.      成熟的分析方法,專業的技術人員;

七、參考文獻


1.   Perez-Cobas A.E. Differential Effects of Antibiotic Therapy on the Structure and Function of Human Gut Microbiota. PLOS ONE, Vol 8, issue 11. (2011)
2.  Catherine A. L. Diversity, stability and resilience of the human gut microbiota.  Nature, vol 489. (2012)
3.   Taylor J.D. Seasonal microbial community dynamics correlate with phytoplankton-derived polysaccharides in surface coastal waters. ISME 8, 245-248. (2014)
 
、常見問題解答
  1.    16S分析樣品要求


答:對于DNA樣品, OD260/280在1.8~2.0之間,濃度大于30ng/µl,總量大于5µg,樣品質檢無降解痕跡。
  1. 樣品測序產出量
答:16S樣品測序后,按照分析要求每個樣品將產出幾萬到幾百萬的reads數。
  1. 從收到樣品到完成測序分析周期
答:收到樣品后,從建庫到高通量測序,一般控制在20個工作日完成。生物信息學基本分析,根據樣品數的多少,一般在20個工作日完成。